Animales
Todo el uso de animales fue aprobado por el Comité de Ética Animal de la Universidad de Tasmania (solicitud 21736) y se llevó a cabo de acuerdo con el Código Australiano de Práctica para el Cuidado y Uso de Animales con Fines Científicos (2013). Las ratas Sprague Dawley fueron criadas por la Facilidad de Investigación Animal de la Universidad de Tasmania y alojadas en jaulas ventiladas individualmente con un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas y acceso libre a comida y agua. Se utilizaron ratas neonatales y embrionarias de ambos sexos para la preparación de cultivos de astrocitos y neuronas, respectivamente.
Fabricación de un dispositivo microfluídico de co-cultivo
Como se ilustra en la Fig. 1a–c, la plataforma de co-cultivo de neuronas-astrocitos microfluídicas de tres compartimentos propuesta consta de dos compartimentos de neuronas/astrocitos (izquierdo y derecho, 1.5 mm × 1.5 mm por compartimento) conectados a un tercer compartimento solo de astrocitos (inferior, 1.5 mm × 3.5 mm) a través de estructuras en forma de laberinto. Estas estructuras en forma de laberinto están diseñadas para inhibir el crecimiento de los axones y prevenir las conexiones sinápticas entre las dos poblaciones de neuronas, permitiendo al mismo tiempo la infiltración de astrocitos en todos los compartimentos. Una característica clave del dispositivo es la capacidad de mantener períodos sostenidos de aislamiento fluido entre los compartimentos, lo que se logra a través de 6 reservorios de fluidos (diámetro de 6 mm) que regulan la presión hidrostática y el flujo de fluidos.
Para fabricar el dispositivo, se creó un molde maestro en un sustrato de polimetilmetacrilato (PMMA; RS components Pty Limited) (75 mm × 50 mm × 2 mm) mediante dos etapas de fotolitografía. Primero, el PMMA se recubrió finamente con una capa de fotoresistente (SU-8 2005, Microchem), se cocinó suavemente, se sobreexpuso y luego se cocinó posteriormente para formar la superficie adhesiva para la segunda capa. El proceso se repitió inmediatamente con una capa de fotoresistente más gruesa (SU-8 3025, Microchem), expuesta con una máscara de transparencia de alta resolución y desarrollada para generar una segunda capa que consistía en un conjunto de laberintos de 10 bancos desplazados (dimensiones: altura = 75 µm, ancho = 50 µm, longitud = 250 µm, intervalos regulares = 50 µm en el eje Y y espaciado entre los bancos = 150 µm en el eje X), un compartimento solo de astrocitos (altura = 75 µm, ancho = 1.5 mm, longitud = 3.5 mm) y dos compartimentos de co-cultivo (altura = 75 µm, ancho = 1.5 mm, longitud = 1.5 mm). El molde se cocinó posteriormente, desarrolló y se cocinó duro. La replicación del dispositivo se facilitó mediante litografía blanda utilizando un agente de curado de prepolímero, polidimetilsiloxano (PDMS) (mezcla 10:1, Sylgard 184, Dow Corning, Inc), seguido de un curado a 70 °C durante la noche. Una vez replicados, los reservorios para medios de cultivo se formaron utilizando un punzón de biopsia (diámetro de 6 mm, Kai Medical).
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Inmunocitoquímica y análisis confocal
Las culturas de solo neuronas o neuronas-astrocitos fueron fijadas con paraformaldehído al 4% (p/v) en PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente y lavadas con PBS al 0.01 M. Las células fijadas fueron permeabilizadas con Tritón X-100 al 0.3% v/v en PBS al 0.01 M durante 30 minutos antes de bloquear en PBS al 0.01 M conteniendo Tritón X-100 (0.3% v/v; Sigma) y albúmina sérica bovina (0.5% p/v; Sigma) durante 30 minutos. Las culturas fueron inmunomarcadas con anticuerpos primarios diluidos en la solución de bloqueo: β-III tubulina (ratón, Promega) para cultivos de solo neuronas, y βIII tubulina y GFAP (conejo, Dako) para co-cultivos de neuronas-astrocitos. La incubación con el anticuerpo primario se realizó durante 1 hora a temperatura ambiente, seguido de una incubación durante la noche a 4 °C. Después de lavar 3 veces con PBS al 0.01 M durante 10 minutos cada uno, las culturas fueron incubadas con anticuerpos secundarios conjugados con Alexa Fluor (1:1000; Thermo Fisher Scientific) en la oscuridad durante 2 horas a temperatura ambiente. Las muestras luego fueron lavadas, montadas en portaobjetos de vidrio y permitidas para secar al aire. Las imágenes fluorescentes fueron capturadas en un microscopio confocal de disco giratorio UltraVIEW con objetivos de 20× y 40×, utilizando el software Velocity (PerkinElmer).
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Análisis estadístico
Las pruebas estadísticas se realizaron en Prism 8.0 (GraphPad). Los datos se derivaron de un mínimo de 3 repeticiones de cultivo por separado. Todos los datos gráficos se presentan como medias ± error estándar de la media (SEM). Para la comparación entre grupos, se utilizaron pruebas de t-test de dos colas no emparejadas, con un umbral de significancia de p < 0.05. Para las comparaciones que involucran más de 2 grupos, se realizó un ANOVA de una vía seguido por la prueba post hoc de Tukey, donde p < 0.05 se consideró estadísticamente significativo.
